BioArt按：
最近一段时间，围绕cGAS-STING信号通的相关研究可谓是雨后春笋般出现，几乎每周都有相关的亮点工作呈现，BioArt也选取一些代表性的工作进行了解读（Cell亮点丨首次发现DNA感受器cGAS定位在细胞质膜上；Nature深度|细菌中也有cGAS？哈佛科学家发现发现一大类cGAS/DncV样核苷酸转移酶；Cell丨张学敏/李涛团队发现“百年老药”阿司匹林参与干扰素通路的调控功能与机制）。
或许，很多人认为cGAS-STING通路已经研究的很透彻了，然而事实上有几个核心关键问题很长时间都没有得到很好的解决。
3月7日，德克萨斯西南医学中心陈志坚教授团队及其合作者白晓晨、张学武等在Nature上同时发表了两篇研究论文（另一篇陈志坚教授团队围绕STING诱导自噬的工作也同时发表在Nature杂志），基于冷冻电镜技术结合一系列生化研究，使STING蛋白作为cGAS和cGAMP下游的关键信号分子发挥生理功能的完整分子机理首次得到全面清晰的呈现，该工作是继cGAS-STING信号通路发现以来又一里程碑式的重要突破。鉴于上述工作的重大意义，BioArt特别邀请到了中科院生物物理所高璞研究员以及邵峰院士对上述工作进行了解读和点评，以飨读者！
解读丨高璞（中科院生物物理所）
点评 | 邵峰（NIBS）
温馨提示：文末附BioArt邮件采访陈志坚教授的相关信息
专家解读
高璞（中科院生物物理所研究员，博后在Dinshaw实验室期间曾围绕cGAS-STING通路的结构生物学问题做出了系列重要的工作）
早在被确定为遗传信息的载体之前，DNA就被发现可以激活免疫反应。然而对细胞质DNA免疫识别通路（cGAS-STING通路）的鉴定，却经历了漫长的旅程。在这条通路主要组分的发现过程中，华人科学家贡献非常突出。这其中包括舒红兵【1】和蒋争凡【2】两个课题组对接头蛋白STING的鉴定，以及James Chen（陈志坚）课题组对DNA受体cGAS及其产物cGAMP的鉴定【3,4】。 随着研究的积累，cGAS-STING通路的重要性已经超出了普通天然免疫通路的范畴，在病原免疫识别、自身免疫反应、抗肿瘤免疫、细胞衰老等方面都具有重要功能。
在主要组分（cGAS/cGAMP/STING/TBK1/IRF3）被鉴定之后，领域内又致力于阐明该通路信号转导的分子机制。经过多家实验室的共同努力，目前对部分步骤有了较为清晰的理解，包括：cGAS如何识别DNA并被其激活、cGAS如何催化ATP/GTP产生cGAMP、cGAMP如何结合STING的LBD结构域并诱导其构象变化、以及STING C端的pLxIS motif如何招募IRF3。但仍有一些核心步骤的分子机制还不清楚，例如：cGAMP如何诱导STING多聚化并将其激活、结合cGAMP后的STING如何招募并激活TBK1、激活后的TBK1如何磷酸化STING和IRF3等。
在今天online的两篇Nature文章中，德克萨斯大学西南医学中心陈志坚、张学武和白晓晨合作团队，运用结构生物学手段，并配合生化和细胞实验，阐明了这些信号转导核心步骤的分子机制。
其中一篇文章Cryo-EM structures of STING reveal its mechanism of activation by cyclic GMP–AMP报道了全长STING非活性状态的二体结构，以及cGAMP结合状态的二体和四体结构。在笔者看来，这项工作至少有以下重要突破：
1）攻克了长期的技术难题。过去10年间，领域内一直尝试解析STING全长的结构，均未获成功。对于x-ray晶体学来说，全长STING很难长出高质量单晶；而对于cryo-EM来说，STING二体（80kD）又显得太小。James团队结合电压相位板，成功利用cryo-EM解析了STING多种状态的结构，这应该是目前用cryo-EM解析的最小膜蛋白近原子分辨率结构。
2）发现了许多意想不到的结构特征。STING跨膜结构域（TMD）与配体结合结构域（LBD）以一种domain-swapped的方式进行二体组装；STING最N端的肽段插入一个由TMD和LBD共同组成的沟槽内，而且这种互作对STING的功能至关重要；结合cGAMP后，LBD相对于TMD竟然发生了180°的巨大旋转，这种旋转使得STING二体之间可以相互packing进而形成多聚。
3）揭示了cGAMP激活STING的分子机制。依据结构信息，结合针对性的功能实验，该工作清晰地揭示了cGAMP诱发STING多聚并将其激活的分子机制。这项工作也为之前很多gain-of-function突变导致的疾病提供了理论解释，并且显然会为后续基于STING的药物开发提供新思路。
另一篇文章Structural basis of STING binding with and phosphorylation by TBK1进一步报道了STING-TBK1复合物的cryo-EM结构，揭示了STING招募并激活TBK1，进而被TBK1磷酸化修饰的结构基础和分子机制。
从机制角度，这项工作有两个重要创新点：
1）从结构上明确了TBK1与STING的互作位点，并利用功能实验确定了互作位点的重要性。
2）综合结构和功能手段，揭示了为什么STING的高聚化对下游信号转导至关重要，这包括：TBK1的trans-autophosphorylation、TBK1对相邻STING C端的磷酸化、磷酸化的STING对IRF3的招募、以及IRF3被临近的TBK1磷酸化。从技术角度，这项工作同样很出彩。作者直接解析了全长STING和TBK1的复合物结构，而并非退而求其次的解析STING LBD（或者C端小肽）与TBK1的局部结构。
除了有助于对上述机制的阐明，这种全长结构还提供了额外信息：
1）一个TBK1 dimer可能更倾向于结合同一个STING dimer来源的两个C端，而不是两个相邻STING dimer来源的C端（下图）。
2）明确了TBK1与STING主体之间的相对构象高度动态，这其实也为TBK1行使功能提供了结构解释。
值得指出的是，除了James团队的这两篇Nature文章，最近在bioRxiv上也出现了一篇关于STING高聚化的工作【5】。该工作通过分析STING LBD与多种配体复合物的晶体堆积界面，提出了STING可能的高聚化方式，这与James团队解析的高聚界面有类似之处（James文章中也对晶体堆积界面进行了分析）。当然毫无疑问，全长STING在不同状态下的真实结构，能更清晰也更有信服力的阐述高聚化的机制。另外，bioRxiv的工作还发现第148位的Cys可以形成二体间的二硫键，进一步帮助了STING高聚化的形成，这是全新的发现，值得领域内跟进研究。
最后，再次祝贺James合作团队的漂亮工作！也再一次感慨James团队总能在最核心的科学问题上做出令人信服的原创贡献。另外，这两项工作也再次表明，hardcore的结构生物学研究一直能够对其他领域的发展起到不可或缺的作用。也许，对不同技术领域的开放和理解，远比刻板和偏见要更接近科学。
参考文献：
1. Zhong B, et al. (2008) The adaptor protein MITA links virus-sensing receptors to IRF3 transcription factor activation. Immunity 29(4):538-550.
2. Sun W, et al. (2009) ERIS, an endoplasmic reticulum IFN stimulator, activates innate immune signaling through dimerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(21):8653-8658.
3. Sun LJ, Wu JX, Du FH, Chen X, & Chen ZJJ (2013) Cyclic GMP-AMP Synthase Is a Cytosolic DNA Sensor That Activates the Type I Interferon Pathway. Science 339(6121):786-791.
4. Wu JX, et al. (2013) Cyclic GMP-AMP Is an Endogenous Second Messenger in Innate Immune Signaling by Cytosolic DNA. Science 339(6121):826-830.
5. Ergun SL, et al. (2019) STING polymer structure reveals mechanisms for activation, hyperactivation, and inhibition. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/552166.
专家点评：
邵峰（中科院院士，NIBS学术副所长）
cGAS-STING通路是机体感受细胞质中异常存在的DNA（包括病原体感染带来的外源DNA和自身细胞核或线粒体泄露的内源DNA），激活I型干扰素免疫反应的重要信号通路。其中，美国西南医学中心的陈志坚（Zhijian“James” Chen）课题组2013年发现的合成酶cGAS是细胞质DNA的免疫受体，在识别胞质DNA后活化，合成环化二嘌呤核苷（cGAMP），cGAMP作为第二信使特异地结合STING并介导STING从内质网转移到高尔基体上形成聚合体，STING聚合体进一步招募下游的TBK1激酶和转录因子IRF3，在高尔基体的STING聚合体平台上，TBK1完成对IRF3的磷酸化修饰，激活IRF3进入细胞核，诱导I型干扰素的表达启动干扰素免疫应答【1】。
实际上，STING蛋白的发现早于上游的DNA受体cGAS。2008年国际上三个独立的课题组相继鉴定出内质网的膜蛋白STING对于抗病毒感染的I型干扰素免疫应答至关重要【2-4】，随后的研究发现，STING还能直接感受细菌来源的第二信使环化二鸟核苷（c-di-GMP）激活I型干扰素的表达【5】。全长的STING蛋白由N端的跨膜区（TM），胞质部分的配体结合区（LBD）和C末端的信号转导区（C-tail）三部分组成。
由于缺乏三维结构的直接证据，早期关于TM边界的划分还存在争议，随后多个结构生物学的课题组同时报道了STING蛋白胞质的LBD二聚体的晶体结构【6-9】。伴随着cGAS和cGAMP的发现，STING的LBD与内源配体cGAMP的复合物三维结构揭示了配体结合带来的LBD二聚体构象变化以及STING激活的部分机制，但是STING蛋白识别cGAMP是如何从非激活态聚合形成激活态，活化的STING聚合体又是如何特异地招募TBK1和IRF3实现TBK1依赖的IRF3磷酸化激活I型干扰素的表达，因为缺乏足够的结构与生物化学机制，人们对这些重要科学问题一直没有清晰的理解，这也是完整理解cGAS-STING通路一直欠缺的重要一环。
美国西南医学中心的陈志坚课题组与张学武课题组、白晓晨课题组合作，在最新的Nature杂志上背靠背发表了两篇非常重要的论文，利用最新的单颗粒冷冻电镜三维重构技术，解析了全长的STING蛋白不结合配体、结合配体以及聚合成寡聚体的近原子分辨率的三维结构，在此基础上进一步解析了配体激活的STING二聚体与TBK1复合物的三维结构，完整地回答了STING蛋白是如何通过配体介导的巨大构象变化实现以二聚体为单元的聚合，并通过C-tail特异地招募TBK1，实现STING聚合体平台上TBK1对IRF3的磷酸化激活的。
在解析全长STING蛋白三维结构的论文中，他们发现STING蛋白跨膜的TM和胞质部分的LBD都以组成型二聚体的形式存在，独特之处在于，连接TM和LBD的铰链区是以交叉方式组装的，这样同一STING分子的TM和LBD分布在二聚体的对侧；cGAMP结合LBD后介导包括铰链区、LBD和C-tail在内整个STING分子胞质部分顺时针旋转180度，铰链区的交叉组装被解开，同一STING分子LBD回到TM同侧，形成肩并肩的STING二聚体。构象变化后的LBD二聚体产生新的分子间作用面，进一步介导STING以二聚体为单元平行排布式的聚合体组装，STING全长分子二聚体的动态激活模型，也很好的解释了发生铰链区的疾病突变体导致STING组成性激活引发自身免疫性疾病的原因。
在另一篇解析配体激活的STING二聚体与TBK1二聚体复合物三维结构的论文中，他们发现STING蛋白C-tail末端的9个氨基酸构成了一个结合TBK1的motif（TBM），完美地结合在TBK1二聚体界面的沟槽内，STING二聚体的两个TBM分别结合在TBK1二聚体界面两个对称的沟槽内，从而实现STING蛋白对TBK1高亲和力的招募。而STING的C-tail中被TBK1磷酸化后结合IRF3的motif紧接在TBM前面，没有足够的连接序列进入TBK1二聚体的活性中心被磷酸化，因此STING和TBK1的2:2结合方式无法招募和磷酸化激活IRF3。只有在STING聚合体平台上结合IRF3的motif可以被相邻的复合物中的TBK1二聚体磷酸化修饰，从而实现对IRF3的特异招募和TBK1依赖的磷酸化激活。针对STING的TBM以及聚合体组装界面上的关键位点突变的生化和细胞功能实验验证了这一聚合体激活模型的正确性。
这两项基于最新的冷冻电镜技术开展的结构与功能分子机制的研究，使STING蛋白作为cGAS和cGAMP下游的关键信号分子发挥生理功能的完整分子机理首次得到全面清晰的揭示，为干扰素抗病毒免疫，以及cGAS-STING通路组成性激活产生的自身免疫性疾病的药物研发奠定了坚实的理论基础。
围绕STING蛋白的分子机理研究只剩下为数不多的问题有待回答，比如，STING蛋白从二聚体非激活态到聚合体激活态为什么需要，又是如何实现从内质网转移到高尔基体的？还有在冷冻电镜技术层面，这个系列工作能把80kDa蛋白的分辨率推到4.0 Å也是非常令人惊叹的。
参考文献：
1. Li, X. D. et al.Pivotal roles of cGAS-cGAMP signaling in antiviral defense and immune adjuvanteffects. Science 341, 1390-1394, doi:10.1126/science.1244040 (2013).
2. Ishikawa, H. & Barber, G. N. STING isan endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling.Nature 455, 674-678, doi:10.1038/nature07317 (2008).
3. Ishikawa, H., Ma, Z. & Barber, G. N.STING regulates intracellular DNA-mediated, type I interferon-dependent innateimmunity. Nature 461, 788 (2009).
4. Sun, W. et al. ERIS, an endoplasmicreticulum IFN stimulator, activates innate immune signaling throughdimerization. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 8653-8658(2009).
5. Burdette, D. L. et al. STING is a directinnate immune sensor of cyclic di-GMP. Nature 478, 515 (2011).
6. Zhang, X. et al. Cyclic GMP-AMP containingmixed phosphodiester linkages is an endogenous high-affinity ligand for STING.Molecular cell 51, 226-235 (2013).
7. Gao, P. et al. Structure-function analysisof STING activation by c [G (2′,5′) pA (3′,5′) p] and targeting by antiviralDMXAA. Cell 154, 748-762 (2013).
8. Kranzusch, P. J. et al. Ancient origin ofcGAS-STING reveals mechanism of universal 2′,3′ cGAMP signaling. Molecular cell59, 891-903 (2015).
9. Zhang, H. et al. Rat and human STINGsprofile similarly towards anticancer/antiviral compounds. Scientific reports 5,18035 (2015).
针对这两篇文章，BioArt独家邮件采访了陈志坚教授。陈教授总结了这两篇文章的意义，原文如下：
- Determines the structure of full-length STING in its inactive and active states, paving the way for further mechanistic studies as well as the development of agonists and antagonists of STING for treating human diseases.
- This is a technical milestone. To our knowledge, STING is the smallest transmembrane protein whose near-atomic structure is determined by cryo-EM.
- Determines the structure of STING-TBK1 complex, revealing for the first time the structure of the STING C-terminal tail that binds to TBK1.
- Elucidates the mechanism of STING activation by the second messenger cGAMP
- Elucidates the mechanism by which STING activates TBK1, which in turn phosphorylates STING, which is important for downstream signaling.
三篇论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1000-2；
https://www.nature.com/articles/s41586-019-0998-5；
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1006-9
编后记：陈志坚教授是华人生物学家中的杰出代表，做出了许多世界级的工作，去年还获得了“生命科学突破奖”。或许有许多读者和编者一样好奇陈教授的实验室会是什么样，其实从硬件上讲和国内实验室并没有两样（下图）…..此处省略500字。
制版人：珂
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来源：知乎 www.zhihu.com
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