内质网和高尔基体的膜泡运输——货物蛋白的分拣与捕获

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我们在第一讲《细胞内功能区隔与蛋白质分选》中提到，不同的机制确保蛋白质分选，转运至细胞的特定部位，才能参与细胞的各种生命活动。将每种蛋白质运送到特定目的地的过程总是与囊泡的发生有密切联系，第二讲《内质网和高尔基体的膜泡运输——膜泡的形成》中，我们又回顾了内质网和高尔基体相关的三类膜泡的组成成分和形成过程。由于传统的实验技术无法满足蛋白质组学发展的需求，在第三讲《如何合理地对蛋白质分选进行预测？》中提到利用生物信息学方法对蛋白质分选进行大规模的预测。本讲内容我们将着眼于内质网和高尔基体，讨论货物分子是如何分拣、捕获进入囊泡的 。

在细胞蛋白质组中，有20%-30% 的蛋白质定位于细胞外环境或细胞内膜系统。内质网(ER)到高尔基体(Golgi)的转运是蛋白分泌途径中的第一步。内质网中的胞外蛋白和分泌通路中细胞器的蛋白被包装到囊泡，并运输到高尔基体。细胞似乎可以区分天然和非天然蛋白质，确保只有适当折叠和组装的货物蛋白质才能进行前向运输。在ER输出期间，许多分泌蛋白被主动分选出来，但是蛋白运输也可以以非选择性方式发生，称为整体流(bulk flow)。 最后，从高尔基体到内质网的逆向运输确保未成熟的货物蛋白或逃逸的内质网驻留蛋白质被有效地运输回ER。

考虑到蛋白质的异质性，接下来我们将讨论货物分子在ER-Golgi界面是如何被识别、分拣和捕获的。

1. 蛋白被选择性捕获的规则

分泌通路内细胞器之间的蛋白质运输是通过球形的、有膜边界的囊泡发生的，这些囊泡从供体细胞器中萌发，并与细胞另一部分的受体融合。这种策略允许分泌蛋白穿过膜屏障，而不干扰细胞器所赋予的区隔功能。保守的细胞质蛋白产生不同类别的运输囊泡，它们主要由驱动其形成的蛋白外壳分类（网格蛋白、COPI 和COPII ）。通过将货物的选择与囊泡的形成相结合，细胞可以实现高效的蛋白质分选。

细胞内运输通路及分泌途径上介导细胞器间蛋白运输的代表性被膜蛋白。

1.1 囊泡外壳的适配器识别分拣信号

通过研究细胞表面受体的内化（网格蛋白介导的内吞作用），首次确定了特异性蛋白信号介导的囊泡货物捕获原理。随后的生化、结构和遗传学手段证实了网格蛋白和其他囊泡成分的功能，揭示了这些组件如何将货物分选与囊泡的形成相联系。特定的衣壳亚基（适配蛋白）识别货物蛋白的分类信号及结合表面，将货物捕获到形成的囊泡中。大多数体外测量系统中，货物蛋白和衣壳只有较低的亲和性，相互作用很弱，这可能对运输过程中动态变化的囊泡很重要。在囊泡的生命周期中，衣壳蛋白从囊泡表面脱落，暴露融合机制，因此衣壳和囊泡成分之间的相互作用必须是可逆的。适配蛋白也常对脂类有亲和力，这有助于招募的特异性和对供体细胞器的亲和力。适配蛋白直接结合到囊泡的结构支架上，从而连接囊泡膜和货物蛋白，并使囊泡膜产生形变。

网格蛋白囊泡的组装和拆卸。衣壳的组装将曲率引入膜中，从而导致芽的形成。适配蛋白结合网格蛋白三叉肌和膜结合的货物受体，从而介导选择性招募的膜和可溶性货物分子进入囊泡。其他的膜弯曲和分裂蛋白被吸收到出芽囊泡的颈部，在那里引入了尖锐的膜弯曲。囊泡抽出后，衣壳蛋白迅速脱落。

1.2 货物受体跨囊泡膜桥接货物和衣壳蛋白

对于衣壳上的适配蛋白来说，分选信号介导的蛋白分选受到信号获取的限制。许多可溶性分泌蛋白和溶酶体蛋白都被脂双层屏障所隔离，排除其与衣壳蛋白亚基直接的相互作用，这些货物蛋白的分选通过受体介导的转运发生。货物受体被定义为同时与货物蛋白质和囊泡外壳相互作用的跨膜蛋白，它们能够有效地将可溶性蛋白质募集到新生囊泡。货物受体的核心功能是将货物结合在一个囊泡区隔中，并在与下游细胞器融合时将其释放。

货物受体在ER和Golgi之间通过循环利用协助底物运输。KDEL受体在分泌蛋白的逆向运输中起作用，它与Golgi中pH值较低的可溶性载货蛋白质相互作用，通过COPl囊泡直接进入ER。在ER的中性pH下，受体将载货蛋白释放到管腔。相反，Erv29(哺乳动物中的Surf4)将蛋白质从ER转运到Golgi，图中也显示了受体蛋白识别

货物受体可以返回到供体以进行下一次运输事件，因此货物受体是长寿命的蛋白质，其介导多个单独的运输轮次。目前还不清楚大多数货物受体是如何在细胞的不同组分之间进行矢量运动的。最典型的例子是KDEL受体(识别序列为 Lys-Asp-Glu-Leu 的ER检索信号)，其在ER和高尔基体之间循环，以遣返逃逸的ER蛋白。这里说的结合和释放依赖于细胞内局部微环境的pH值，在顺式高尔基体的低pH环境中，受体结合靶蛋白的分选序列，但在ER腔的中性pH环境中，这种相互作用被逆转。对于其他受体-货物对，额外的腔内条件（如离子浓度）也可能会影响其结合。此外有证据表明存在货物分子驱动的KDEL受体定位调节，表明该受体不仅仅是一个惰性平台，还可能通过货物结合的变构效应来响应货物分拣需求。

Rer1作用于跨膜货物蛋白的回收运输。 货物受体通常通过嵌入膜内的极性残基与货物蛋白的跨膜结构域相互作用。 然后通过其细胞质结构域募集COPI 被膜，将货物蛋白递送至ER。类似但方向相反，Erv14与ER中的跨膜结构域结合并将它们聚集至ERES，在那里它们通过COPII 囊泡被有效地转运至高尔基体。

尽管膜内在蛋白和跨膜蛋白原则上可以直接与囊泡衣壳的衔接蛋白发生互作而不需要借助货物受体，但是已经在多种途径中发现了使用受体的膜蛋白运输实例。 这些膜货物受体可以简单地提供货物中不存在的分选信号，但是它们还可以在伴随跨膜结构域（如Erv14/CNIH）中发挥额外作用并识别或回收寡聚复合物的未组装组分（如Rer1）。Rer1 和Erv14 以一种受调控的方式结合并捕获靶蛋白，并在它们返回其原始位置之前将其释放到另一个细胞间隔。对于它们如何根据细胞区调节膜嵌入相互作用的识别和释放涉及的机制仍然知之甚少。

2. 蛋白分选机制：ER和高尔基界面上的适配蛋白

在之前的文章中，我们已经介绍过不同性质的囊泡介导不同方向的运输，这里我们详细讨论不同囊泡的货物识别。

2.1 货物蛋白被招募进入COPII 囊泡是ER输出过程的起始

正确折叠组装的分泌蛋白、膜蛋白被选择性地捕获到COPII 囊泡中，标志着新合成蛋白进入分泌途径的开始。关于COPII 囊泡的组分和形成我们在之前已经详细讨论过，这里不多赘述。COPII 衣壳蛋白的组装发生在称为ER出口位点（ERES）的膜区域，在捕获到新生囊泡之前或同时，货物蛋白质在ERES处瞬时积累。在ERES存在一定程度的蛋白质质量控​​制，使得ER定位的蛋白和错误折叠的蛋白被排除在这些区域之外。

Sar1-GTP 将 Sec23/24 募集到ER形成预出芽复合物时，标志着COPII 囊泡萌芽的起始。Sec13/31通过 Sec23/Sar1 和 Sec31之间的相互作用被募集。Sec13/31驱动膜弯曲并在新生囊泡上形成笼状外层，而Sec23/24负责货物蛋白的选择。

Sec24亚基是COPII 囊泡的货物衔接蛋白。遗传、生化和结构研究证实了一系列货物蛋白和Sec24的相互作用，揭示了COPII 囊泡形成中货物特异性的基础。酵母Sec24至少有四个不同的货物蛋白装载位点，这些位点识别不同的分拣信号，从而使同一种囊泡可以输出的货物范围多样化。哺乳动物Sec24包含一个额外的特征性货物结合位点，识别另一种信号。通过组合表达不同形式的Sec24亚基可以进一步实现货物输出的多样性。例如酵母表达（Iss1/Sfb2和Lst1/Sfb3）、哺乳动物表达（Sec24A/B和Sec24C/D），每种组合都具有不同的货物特异性。除了简单地拓展货物识别范围，不同的Sec24亚型也可能影响囊泡形成的结构。例如Lst1/Sfb3 亚型是包装大的寡聚蛋白Pma1所必需的，并且它们产生的囊泡大小要比仅有Sec24时产生的囊泡大。因此可以基于衣壳蛋白和底物的特定组合，对囊泡的几何形状进行人为设计，或者通过招募适当的适配蛋白亚型，使货物蛋白本身影响所形成的囊泡的几何形状。

COPII 介导ER向高尔基体的运输，Sec24是货物适配蛋白，含多个货物结合位点(A-D)，驱动不同蛋白的捕获。

Sec24识别的分选信号包括简单的氨基酸基序和折叠表位，目前尚不清楚单个Sec24分子一次可以结合多少种不同的分选信号。目前关于Sec24对货物结合的大部分信息来自Sec24与其结合的合成中肽链的分选信号区段共结晶结构解析，因此每个完整的货物蛋白在Sec24表面上占据的完整足迹仍不清楚。Sec24本身似乎是一种惰性货物装载平台，因为它在货物装载时不会发生构象变化。在这方面，COPII 系统不同于网格蛋白货物接头复合物，其在货物结合时经历构象变化以触发囊泡形成，而COPII 囊泡的产生可能是由非囊泡固有组分调节的。

左：浓缩分泌蛋白，从而提高效率。中：通过与COPII 衣被蛋白相互作用，使囊泡产生特殊形状或大小，以适应货物增加特异性。右：对运输进行质量控制，选择成熟和适当修饰的蛋白，从而提高准确性。

2.2 货物招募到COPI 囊泡：高尔基体到ER的回收

COPI 囊泡介导蛋白的回收，包括逃逸的ER驻留蛋白回收和ER-高尔基体间连续循环的运输机器回收。 COPI 囊泡也称为外被体(coatomer)，结构复杂，由7个亚基（α，β，β’，γ，δ，ε和 ζ-COP），其被招募并组装成完整的复合物膜。COPI 囊泡可以在生化上分为两个亚复合物：由 α，β’ 和 ε 组成的三聚体（称为B-亚复合物）和由 β，γ，δ 和 ζ 组成四聚体（称为F-亚复合物）。关于COPI 衣壳蛋白的生物信息学和晶体学分析显示，COPI 衣壳蛋白有类似于网格蛋白和COPII 衣壳蛋白的结构基序，包括与β-螺旋结构耦合的扩展和α-螺旋形的管状结构域。然而这些不同结构元件在每种囊泡中的布局和组装是不同的。

COPI 介导高尔基体到ER的逆行运输和高尔基体间运输，货物结合亚基形成拱形结构，通过N端结构域接触膜并与货物分子互作。

尽管四聚体F-亚复合物与网格蛋白的衔接蛋白复合物(AP复合物)存在相似性，但结构分析已明确了B-亚复合物的 α-COPI 和β’-COP 的 β-螺旋结构域是与 ER驻留膜蛋白的主要检索信号（二赖氨酸基序）互作的位点。然而F-亚复合物可能在货物结合中起作用：β 和 δ 亚基对基于精氨酸的回收信号分选是很重要，并且p24家族蛋白胞质的小尾巴上芳香族氨基酸直接与F-亚复合物结合。δ-COP 结合胞质辅助蛋白Dsl1 的 WxW 基序，尽管这种相互作用发生在可能位于膜表面远端的位点。另外，在F-亚复合体上仍有可能存在其他识别或结合货物蛋白的表面结构，或者COPI AP样复合物上的蛋白互作位点可能在货物结合之外的调节中进化出了特殊功能。

对组装中COPI 亚基排列方式的了解来自 COPI 囊泡的低温电子断层扫描和晶体结构在EM密度中的全局拟合。α-COP 和 β’-COP 二聚体的货物结合表面接近膜，它们的α螺旋结构域形成拱形结构指向膜外，一旦与F-亚复合物结合很容易为膜的形成发挥支架作用。γ-ζ-COP 二聚体和 β-δ-COP 二聚体共同形成的四聚体也形成了一个铰链状结构，类似于网格蛋白AP复合物，但可以形成更伸展的构象。COPI 囊泡F-亚复合物和AP复合物之间结构差异仍有待研究，这些差异可能对货物捕获到囊泡很重要。

网格蛋白囊泡可由多种细胞器形成，如TGN、内吞体、细胞膜等，网格蛋白囊泡结合不同类型的受体，就形成不同运输性质的小泡，受体AP1 参与高尔基体→内吞体的运输、受体AP2 参与质膜→内吞体的运输、受体AP3 参与高尔基体→溶酶体的运输。

现在认为网格蛋白囊泡的适配蛋白在细胞质中是“封闭”构象，在膜结合时转变为“开放”构象，暴露网格蛋白结合位点以触发囊泡形成。因此在网格蛋白系统中，囊泡形成与货物装载机械相关，只有当适配蛋白复合物与其配体结合时才会形成囊泡。与此相反，COPI 囊泡结构在没有货物蛋白质的情况下形成，但脂质双层的存在已经处于“高度开放”构象。这些结构的重排是如何整合货物结合、膜结合和衣壳蛋白组装的，我们仍不清楚，但似乎变构效应会影响COPI 囊泡的组装。

3. 分拣机制：货物受体的不同作用

3.1 ER输出中的货物受体

大量的货物蛋白质作为可溶性蛋白穿过ER，它们与COPII 囊泡上受体的互作极大程度地决定了捕获过程。受体介导ER输出的一个特征是，通过使用货物受体、适配蛋白和辅助因子，被选择性招募到囊泡中的蛋白质的多样性受到不同层级的放大。每个Sec24的同源物都有几个结合口袋，为不同载货受体结合提供可能，每种受体可以与不同的适配蛋白互作，从而增强底物的广泛性和特异性。

COPII 与分泌蛋白特异性结合的层级放大效应。

受体介导ER输出的第二个重要特点是，在蛋白质完成折叠的情况下调节转运。蛋白质正确折叠的情况下货物受体仅结合其配体，只有成熟的分泌蛋白质将离开ER的富含伴侣蛋白的环境。错误折叠的蛋白质与受体结合，刺激转录调节（信号或转录因子）的产生。这种信号转移到细胞核，激活编码伴侣蛋白和其他ER成分的基因，从而促进蛋白质的正确折叠和加工。对特定货物受体如何识别其底物的机制仍有待研究。

ER内错误折叠的蛋白触发伴侣蛋白的产生和ER的扩张，促进蛋白质的正确折叠和加工。

货物受体还可以介导跨膜货物蛋白和外壳蛋白之间的相互作用。 在某些情况下，这些跨膜蛋白缺乏自己的ER输出信号，需要一个受体连接到囊泡。糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的蛋白质在其合成并整合到ER中后通过脂质部分嵌入ER膜中。 它们缺乏与COPII 外壳相互作用的胞质结构域，而是依赖于称为p24家族的受体家族。这些丰富的寡聚蛋白通过有效掺入COPI 和COPII 囊泡而在ER 和 顺式高尔基体之间循环。p24蛋白在所有真核生物中都是保守的并且具有特点结构域。虽然货物识别的分子细节仍不清楚，但p24蛋白似乎在识别GPI 锚定的碳水化合物部分时起凝集素的作用。一旦GPI 连接被适当地重塑，货物仅与受体复合物接合，p24家族似乎也起到读取蛋白质成熟信息的作用。

酵母中GPI-APs活性调控ER出口的模型。蛋白附着后，GPl锚点的脂质和聚糖部分被重构，将GPI-APs分类并集中于其特定的ERESs，允许p24复合物的后续招募。

尽管含有自身的ER输出基序，一些质膜蛋白的转运仍然需要货物受体。在这种情况下，有效的ER输出需要多个信号：货物蛋白质本身存在分选信号，货物受体也提供输出信号。典型的例子是酵母Erv14（哺乳动物中的CNIH），其作为许多质膜驻留蛋白的受体起作用。Erv14可能作为货物受体发挥多种功能。首先，它通过细胞质环提供COPII 外壳的亲和力，不管它转运什么底物，这一功能都是必需的。一些情况下，Erv14 信号增强了Sec24 与货物蛋白内源分选信号之间的相互作用，从而使结合了Erv14的货物对COPII 衣壳的亲和性增强。其次，Erv14可能作为分子伴侣，作用于拥有长跨膜结构域的质膜定位蛋白质。另外，因为Erv14通过嵌入脂双层的结合位点与货物互作，所以它可以作为质量控制因子，使其仅在底物蛋白跨膜结构域正确组装时结合，从而将COPII 底物的募集与蛋白折叠、质量控制等过程相耦联。

Sec24识别两个信号驱动ER输出：Yor1等通过Erv14的IFRTL基序与Sec24B位点直接互作，间接与Sec24D位点互作。Gap1使用Erv14但通过未知的额外E位点与Sec24结合。一些Erv14靶蛋白（如Tpo4等）不使用Sec24上已知的结合位点，可能Sec24上还有另外的识别位点，或者货物导出完全依赖Erv14与Sec24之间的互作。

3.2 逆行COPI 运输中的货物受体

介导ER驻留蛋白从高尔基体到ER回收的受体是较早被鉴定出的货物结合转运受体。酵母Erd2结合在ER驻留蛋白上的四肽基序KDEL或HDEL(His-Asp-Glu-Leu)。人类有三种同源受体：ERD21、ERD22和ERD23，它们似乎有略微不同的底物偏好。所有这些受体都有七个跨膜结构域，它们直接与货物蛋白和COPI组分互作。KDEL受体的货物结合和释放受高尔基体和ER内腔pH的差异调节，较低的pH环境促进与货物的结合，较高的pH有利于释放。对于缺乏已知分选信号的可溶性货物蛋白，其逆向运输受体是Erv41-Erv46复合物。Erv41和Erv46是两个相关的蛋白质，具有跨膜结构域和大的腔内结构域。Erv41-Erv46复合物与货物蛋白质(如Fpr2, Gls1等)以一种与KDEL受体相似的pH依赖性方式相互作用。

KDEL受体DRE2结合分选信号(KDEL配体)，诱导顺面高尔基萌芽复合物形成，并作用于ER驻留蛋白的逆向运输。

与顺行途径一样，并非所有需要回收的膜蛋白都有自己的分选信号。ER回收受体Rer1介导不含KKXX和K/HDEL信号的多种ER膜蛋白从高尔基体逆向运回。在酵母中，这些货物包括驻留的ER机器（Sec12，Sed4，Mns1，Sec71和Sec63），以及在顺行途径运输之前需要组装的复合物单体或亚基。 在后一种情况下，Rer1识别嵌入跨膜结构域内的极性残基，这些残基通常在组装的复合物中被掩蔽。人类RER1也能作为ER检索受体发挥同样的功能。ER检索还使用辅助蛋白来促进、扩展货物结合。

骨骼肌的烟碱乙酰胆碱受体由五个亚基逐步组装而成。质量控制机制确保只有完全组装好的受体才能到达细胞表面。Golgi-ER回收受体Rer1参与乙酰胆碱受体的生物发生。通过将未组装的a亚基局部化至早期分泌通路，Rer1是肌肉乙酰胆碱受体表面表达的重要且独特的控制因子。

4. 仍有疑问：非典型性运输和底物选择

近年来，随着结构生物学方面的许多进展，我们对蛋白质的分选机制有了更详细的了解，特别是囊泡的装配和货物蛋白与衣壳蛋白间的互作。然而对这些细胞学过程和调控机制的了解仍在不断深入，”货物-衣壳蛋白变构效应”是运输适应特定细胞条件的关键。进一步的进展来自对非经典运输的研究，我们开始意识到已知系统的可塑性和新特定因素的功能相关性。这些蛋白分选的新例子很可能会继续推动这一领域的发展。

“非经典运输” 的一个例子实际上是一种旧模式的复兴：非选择性的大规模蛋白整体流(bulk flow)。一些货物离开ER，尽管可能仍然以COPII依赖性方式，但没有浓缩成囊泡或与囊泡外壳相互作用。鉴于已知的货物接收器仅仅是分泌物的一小部分，必须重新评估通过大量货物的随机出口作为货物运输的重要机制。最近使用新的惰性和快速折叠标记对哺乳动物细胞中的大规模蛋白整体流进行定量表明，大量液体和蛋白质以非选择性方式通过分泌途径，这是否适用于其他细胞类型和物种仍有待观察。同样的，在逆行囊泡中是否也发生了大规模蛋白整体流也没有经过测试，并且从顺行事件中解剖可能是技术上的困难。面对大规模蛋白整体流输出时，不完全折叠的蛋白质和ER驻留蛋白会不会被阻止捕获到囊泡中仍不清除，需要进一步表征。 ER驻留蛋白分子伴侣之间的保留信号和广泛的相互作用可能会阻止一些蛋白质进入囊泡，但这些影响的性质和程度在很大程度上是未知的。

与选择性问题相关的是，在分选信号介导的运输和非选择性的大规模蛋白整体流的运输过程中，蛋白质的折叠如何影响它们从ER到高尔基体的运输。这是一个重要的问题，因为没有在ER腔内正确折叠的新生蛋白被输出后往往被降解或者造成细胞环境紊乱。原则上，ER和Golgi中的货物适配蛋白和货物受体可以直接决定运输的保真度。ER受体可以区分完全折叠蛋白和需要进一步裂解作用的蛋白，高尔基受体将绑定错误折叠的货物以便回收到ER。在实践中，这种模型可能对某些错误折叠的蛋白质有效，但不太可能适用于所有蛋白质。首先，一些ER输出信号是简单的肽，当蛋白质在膜的腔侧折叠时似乎不太可能改变。也许更重要并令人费解的是，许多不完全折叠的蛋白质和ER驻留的蛋白质实际上是运输组分。因此更准确地说，功能性ER输出信号与ERAD共存，保留信号和顺向传输受到多个竞争交互的动态控制。此外，在严重的ER胁迫下，分选信号可用作ER解毒途径。类似的问题涉及如何在高尔基体中识别错误折叠的蛋白质，并且需要量化何等程度的ER逆向运输有助于维持ER稳态。这些途径之间的相互作用是许多错误折叠疾病的核心，这些疾病源于ER-高尔基体界面蛋白质分选质量控制的缺陷。

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来源：知乎 www.zhihu.com

作者：鑫波和他的小鱼干

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