今年11月，Baylor Collage of Medicine的Li Nuo组在Nature发文：A cortico-cerebellar loop for motor planning，利用小鼠工作记忆的行为范式，结合灵活的神经组织破坏、光遗传、电生理首次直接的揭示了小脑对于工作记忆、运动规划的作用和一些机制。

这篇文章以其非常严密而细致的推理链条，近乎用到了系统神经科学可以用到的所有研究方法。从行为模型，脑损坏研究，到光遗传、电生理，然后是光遗传电生理的灵活结合，以及脑连接分析。最后以群体层次的电生理分析结尾，非常严密，比较值得学习一下。所以我在这里详细的总结一下这篇文章的严密的推理链条，给大家展示一下如何综合这么多神经科学的研究手段进行系统性的推理探究过程。

Overview

这篇文章用到的技术手段很多，主要的框架和大体走向大概是这样的

第一部分是行为层面上的分析。从建立行为范式开始，首先是经典的脑损伤研究，通过损毁特定区域，观察对行为上的影响。

在损毁研究得到初步结论，找到感兴趣的脑区以后，利用光遗传进行时间上精确的神经活动操纵。首先是直接利用ChR2激活神经元的作用，在工作记忆任务的各个时间阶段，对该区域的神经元选择性的活动进行干扰，观察对行为的影响；接着利用ChR2激活抑制性的神经元，达到光抑制的目的，在工作记忆任务的各个时间阶段，对目标脑区进行抑制，观察行为的影响。从而探讨该脑区在工作记忆不同阶段所起的作用。

第二部分在第一部分基础之上的电生理研究。从简单的记录目标区域在工作记忆任务各个阶段的神经活动(firing rate)并分析对于工作记忆不同记忆内容的选择性(selectivity)的不同的活动开始。然后灵活结合光遗传以及电生理的记录。在不同脑区记录神经活动，光遗传操纵，从而在探究整个神经环路对于该工作记忆任务编码所起的作用。

最后一步是对传统电生理分析(firing rate, selectivity)的进一步分析，通过一个简单的，population level的电生理分析(cd, coding direction)，进一步揭示在环路中，不同脑区神经元相互之间所起的作用，从而完整的对小脑的Fastigial Nucleus、前额叶ALM区域在工作记忆任务中所起的协调性作用进行解释。

行为模型

这篇文章上用的是一个非常经典的，老鼠运动准备(Motor Preparation)的工作记忆模型，在svoboda组很常用，比如 (Li et al., 2015; Li et al., 2016; Guo et al., 2014; Guo et al., 2017)。

首先是1.3s的感知采样（sample）阶段，老鼠用胡子感受一个金属棒是在前（红色），还是在后（蓝色）。经过大约1.3s的延迟delay阶段后，老鼠根据sample阶段感知到的棒的位置进行反应，棒在前，舔左边的管子喝水，棒在后则舔右边的管子喝水，从而获得奖励。

这其实是一个经典的motor preparation或者说是movement planning的任务，因为老鼠不需要在延迟阶段记忆棒的位置，它只需要在sample的后半段时期，将棒位置的信息转化为它在1.3s后要去往左边还是右边，从而只记住这个信息(Svoboda & Li, 2018)。

我们已知，老鼠前额叶ALM区域对于这个运动准备的维持和编码起着非常重要的作用。

这篇文章后续的探索都是基于这个经典的行为范式进行的。

脑损毁研究

为了探究小脑在这个运动准备任务中所起的作用，最经典而且最显而易见的做法便是通过损毁研究，损伤小脑的某一个区域，观察对老鼠执行任务的影响，从而对该脑区的功能进行基本的推断。

作者在这里，用强激光照射，精确的烧毁了和ALM脑区存在连接的小脑核团(Fastigial nucleus顶核？ , dentate nucleus 齿状核？)。进而观察分别损毁这两个区域后老鼠执行运动准备任务的变化。

作者发现，损毁Fastigial nucleus后，老鼠做任务的准确率下降非常厉害，而dentate nucleus没啥影响。除此之外，损毁Fastigial nucleus会略微影响老鼠开始舔的反应时，但是老鼠一旦开始舔，舔频率没有什么影响。所以作者首先推断，Fastigial nucleus在这个运动准备工作记忆任务中起到了一定的作用。

光遗传：激活研究

前面的脑损毁研究只是非常粗糙的脑区层面的研究，然而在任务的各个状态，大脑所表征、编码的内容是不一样的，所以这就需要利用光遗传的时间分辨率进行不同任务状态时间内精确的干扰。作者在这里，对任务的不同阶段：采样早期，延迟期以及运动的时期的早期分别给予光遗传的激活，观察对老鼠行为的影响。我们认为：这样的激活可以改变大脑本来有条理的编码，相当于打乱、干扰了大脑的编码。

作者观察到的主要现象是：在采样早期干扰没有显著的影响，在延迟阶段干扰则会让两个方向的准确率都下降，在响应阶段干扰（激活，加强）一侧脑区的活动，则会产生一个同侧的偏移，即老鼠更偏向选择激活侧的同侧（比如激活左边小脑Fastigial nucleus，老鼠更偏好左边），总结如下图。

这个结果告诉我们，在任务的不同阶段，Fastigial nucleus在任务中扮演的功能是不同的，是随着时间变化而变化的(Temporally specific)

光遗传：抑制研究

相反的，再利用光遗传，对这个区域进行一下抑制(激活抑制性的Purkinje细胞)，观察对行为的影响。会不会只是因为这个区域的激活会造成干扰呢？如果没有这个区域的活动会怎么样呢？

结果非常的类似，但是又稍有不同：在采样早期干扰没有显著的影响，在延迟阶段干扰则会让两个方向的准确率都下降，在响应阶段干扰（激活，加强）一侧脑区的活动，则会产生一个对侧的偏移，即老鼠更偏向选择激活侧的对侧（比如激活左边小脑Fastigial nucleus，老鼠多舔右边），总结如下图。

这个提示我们，Fastigial nucleus在sample period后半段开始的时期的神经活动编码，对于老鼠正确执行工作记忆任务非常关键。

行为层面的分析在这里已经结束，能做到这个程度一般也分析的差不多了。后面就到了电生理为主的阶段，通过电生理，分析这个脑区起到的编码作用，再通过电生理结合光遗传，精确的观察该脑区在这个时间到底在编码什么内容，又会怎么样的与其他脑区协同作用。

电生理记录

电生理是非常重要的神经科学研究手段，通过高速记录的颅内电极信号(一般是30kHz左右的采样率)，可以记到一些混合的动作电位的发放活动，然后spike-sorting，分离各个细胞的动作电位，然后对齐到任务的各个时间状态附近，做PSTH(peri-event time histogram)图，从而我们根据这个神经元在不同任务条件或者刺激或者动作的不同，观察神经元活动的不同，从而推断这个神经元所起的编码的作用。

在以前的研究中(Guo et al., 2014)，已经探究到了ALM对于这个运动预测工作记忆的表征。人们发现了，有的ALM神经元在工作记忆延迟时期对不同工作记忆的条件有维持(Persistent)或者不断增长(Ramping)的活动，还有的ALM神经元只在运动时刻活跃等等不同类型，他们对于不同的工作记忆条件下都有选择性(左、右方向的记忆)。而且选择性都是随着任务时间不断上升的。

在Fastigial nucleus以及小脑其他核团内，我们同样可以观察到神经元对于不同工作记忆条件不同的活动（选择性活动），而且神经元发放选择性随时间的趋势变化也和ALM差不多，不过值得注意的是，在运动发起时间，有一个非常大的选择性的提升。这表明了小脑神经元广泛的存在运动准备以及运动发起相关的神经活动。

电生理结合光遗传抑制

搞清楚了小脑神经元对这个运动准备也有编码，下一步我们要看这个编码在真个运动准备工作记忆相关的脑环路上扮演着怎么样的作用，而搞清楚这个作用的关键，就是搞清楚这个小脑神经元对运动准备的编码活动，从哪儿来，到哪儿去。即这个运动准备的活动，从什么脑区传过来，又会去怎样影响其他脑区。

搞清楚这个，最好的方法就是结合光遗传抑制，观察电生理的结果：抑制其他编码这个信息的脑区(ALM)，记录小脑核团(CN)，观察影响；抑制CN，记录本来编码这个信息的其他脑区，观察影响。

这个实验就是这么做的。

首先是利用光遗传，抑制ALM活动，观察CN内神经元的活动，主要是观察CN内神经元发放频率和对工作记忆内容的选择性(Selectivity)上。

大家可以看这个图的图b，x轴是对对侧目标的selectivity，主要是normalize后这个神经元在对侧目标时的firing rate-同侧firing rate。越大代表这个神经元在老鼠舔向对侧的时候发放活动比同侧高的越多。y轴代表在光抑制和没有抑制情况下神经元firing rate的差值。越大代表在光抑制ALM后，CN神经元活动性越强。黑色点代表差值显著。统计结果显示：ALM被抑制以后，CN绝大部分神经元的活动增加了。图c是selectivity相对于时间的变化，看右图可以发现，经过光抑制，CN神经元的selectivity显著的降低了。总结如下图。

这个结果告诉我们：来自ALM神经元的输入对于CN神经元在delay时期维持对工作记忆内容的编码，以及其自身的活动很重要。解决了CN神经元编码从哪儿来的问题。

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按照开始说的，研究研究CN的编码从哪儿来，到哪儿去。已经解决掉了从哪儿来的问题，现在作者进一步探究了CN神经元活动传递到哪儿去的问题。

在这一步，作者用光遗传抑制了CN区域的活动，观察ALM神经元活动的改变，如下图。

这三个图的画法和上一个图差不多。从图e结合神经元统计结果可以看出来，抑制CN以后，ALM神经元群不太有显著的发放频率的改变。有的神经元发放增强有的减弱，但是总体数量差不多。

但是回到选择性上，图f蓝色部分可以看出，delay时间段，ALM区域编码的选择性被完全削弱，也就是说，无论老鼠感受到怎样的刺激，怎样规划的，在ALM的编码上无法体现出来了：这就告诉我们：CN神经元的活动也对ALM对工作记忆内容的编码起着很重要的作用。这个图的总结如下：

结合上面抑制ALM的结果，我们可以发现CN，ALM各自都对另一方工作记忆内容的编码起着非常重要的作用，揭示出了这样一条神经环路：ALM到CN，CN再回到ALM，在这个环路中编码着工作记忆的内容。

电生理结合光遗传激活

但是工作记忆也被维持在ALM-Motor Thalams 的互相激活的环路中(Guo et al., 2017)。CN到ALM的这一条环路和上面这一条环路有什么交互性的互相影响呢？在上面的光遗传抑制两个区域的实验中，光抑制了整个工作记忆delay时间段。如果我们要阐明这两个互相影响的关系，最好的方式是：我们实施一个短时间的干扰，观察对固有的维持性工作记忆活动的影响。

作者是这样做的：在delay开始的前0.5s，对CN神经元激活，观察ALM神经元的活动。

作者得到了这样的结论：CN的Fastigial nucleus被短暂的激活了一下以后，大部分ALM神经元失去了原本的对不同工作记忆内容的选择性的活动，表现的都差不多了；一小部分ALM神经元重新建立了另外一种选择性活动。这个短暂的刺激消失好几秒以后，对ALM神经元的活动影响依然存在。不过CN的Dentate nucleus的短暂的激活不会带来这么大的影响，只会在更短的时间改变ALM的活动，也几乎不会抹掉ALM神经元的选择性。总结图是这样。

群体层面电生理分析

前面的分析基本都是基于单个神经元水平，但是大脑有以后会利用很多神经元，以群体编码的性质编码信息，这个特征在运动相关的皮层得到过证实(Georgopoulos et al., 1986)。所以如果能从群体编码的方面（相当于群体水平的selectivity），定量观察抑制CN不同区域对ALM神经元活动的影响，那么得到的结论会更具有说服力。

在这里作者用了一个非常经典而巧妙的方法(沿用 Li et al., 2016)–coding direction, cd.

这个方法的思路就是吧每个神经元当作单独独立的维度，以时间顺序表征整个任务的过程。在每个时刻，计算两种不同任务(左边工作记忆，右边的工作记忆)之间的高纬度向量的长度。越长代表在群体水平他们编码分的越开。

计算方法也非常的简单，直接对加窗平均的firing rate向量做差即可。

但是这个方法非常的有效。

上图是ALM区域在任务不同时刻coding direction的大小。可以看出，在sample时刻，cd差值(population level selectivity)逐渐增加，在delay时候达到最大，然后在运动执行以后再度变小。这就代表了ALM区域所编码的工作记忆信息在delay时候最强。

如果在delay开始之后的前0.5s干扰CN的Fastigial nucleus活动，我们就会看到这个population level的selectivity掉的非常厉害，基本上混到了一起，表明了在这个时候群体水平的对工作记忆内容的编码也被严重的削弱了。相对应，Dentate nucleus没有产生什么大的影响。

与single neuron结果相对应，群体水平的分析也揭示了相同的结论：Fastigial nucleus的选择性活动对于ALM区域的工作记忆内容的维持，对于工作记忆整个任务上都扮演了至关重要的作用。

结论

脑区损毁，光遗传层面的行为分析揭示了CN的Fastigial nucleus对于小鼠运动准备工作记忆起到了很大的作用。而由作者结合电生理、光遗传的分析揭示了Fastigial nucleus也是工作记忆环路中非常重要的一个node。这也是人们首次非常严密证实了小脑对于工作记忆环路的参与。

我自己思考的还有一点点残留的问题

我对文章主要的内容总结就是这样，可以看到作者的故事讲的还是非常好，逻辑链推理还是非常严密的。这是一篇非常好的系统神经科学文章，这个文章讲的各种方法由浅入深，从最基本的脑区损毁到最后群体水平的电生理分析，一步一步上升，环环紧扣，系统性的，从各个方面，各种手段观察了这个脑区对这个运动准备工作记忆任务的贡献，十分具有参考意义。

不过，我还有点小小的问题，先抛到这里供大家一起思考思考讨论讨论：

• 为什么已经有一个ALM到thalALM的维持这个工作记忆的神经环路，而且是单个突触，直接连接的，还会存在这样一个间接，抑制型的环路呢？ 提示：Attractor.
• 抑制CN以后，ALM整体的firing rate没有太大的波动，那么会对thalALM的活动产生什么影响？这个文章为什么没有讨论讨论抑制CN或者激活CN以后对thalALM的影响？
• 为什么只讨论短时间激活CN，没有对应的短时间抑制CN？
• 这个文章无论激活还是抑制CN都是单侧操作，双侧操作会有怎么样的结果？行为上，电生理上？

（后面这几个我也不知道为啥。。）

以后想到会再更新补充补充问题。

参考文献

• Gao, Z., Davis, C., Thomas, A. M., Economo, M. N., Abrego, A. M., Svoboda, K., . . . Li, N. (2018). A cortico-cerebellar loop for motor planning. Nature, 563(7729), 113-116.
• Georgopoulos, A. P., Schwartz, A. B., & Kettner, R. E. (1986). Neuronal population coding of movement direction.Science,233(4771), 1416-1419.
• Guo, Z. V., Inagaki, H. K., Daie, K., Druckmann, S., Gerfen, C. R., & Svoboda, K. (2017). Maintenance of persistent activity in a frontal thalamocortical loop. Nature, 545(7653), 181-186.
• Guo, Zengcai V., Li, N., Huber, D., Ophir, E., Gutnisky, D., Ting, Jonathan T., . . . Svoboda, K. (2014). Flow of Cortical Activity Underlying a Tactile Decision in Mice. Neuron, 81(1), 179-194.
• Li, N., Chen, T.-W., Guo, Z. V., Gerfen, C. R., & Svoboda, K. (2015). A motor cortex circuit for motor planning and movement. Nature, 519(7541), 51-56.
• Li, N., Daie, K., Svoboda, K., & Druckmann, S. (2016). Robust neuronal dynamics in premotor cortex during motor planning. Nature, 532(7600), 459-464.
• Svoboda, K., & Li, N. (2018). Neural mechanisms of movement planning: motor cortex and beyond.Current opinion in neurobiology,49, 33-41.

来源：知乎 www.zhihu.com

作者：李竞捷

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